生物化學(xué)實驗基本技術(shù)：破碎技術(shù)

除了某些細(xì)胞外的多肽激素和某些蛋白質(zhì)與酶以外，對于細(xì)胞內(nèi)或多細(xì)胞生物組織中的各種生物大分子的分離純化，都需要事先將細(xì)胞和組織破碎，使生物大分子充分釋放到溶液中，并不丟失生物活性。不同的生物體或同一生物體的不同部位的組織，其細(xì)胞破碎的難易不一，使用的方法也不相同，如動物臟器的細(xì)胞膜較脆弱，容易破碎，植物和微生物由于具有較堅固的纖維素、半纖維素組成的細(xì)胞壁，要采取專門的細(xì)胞破碎方法。

1.機(jī)械破碎

（1）研磨

研磨是將剪碎的動物組織置于研缽或勻漿器中，加入少量石英砂研磨或勻漿，即可將動物細(xì)胞破碎，這種方法比較溫和，適宜實驗室使用。工業(yè)生產(chǎn)中可用電磨研磨。細(xì)菌和植物組織細(xì)胞的破碎也可用此法。

（2）勻漿

勻漿這是一種較劇烈的破碎細(xì)胞的方法，通?？上扔眉矣檬称芳庸C(jī)將組織打碎，然后再用10000r/min-20000r/min 的內(nèi)刀式組織搗碎機(jī)（即高速分散器）將組織的細(xì)胞打碎，為了防止發(fā)熱和升溫過高，通常是轉(zhuǎn)10秒-20秒，停10秒-20秒，可反復(fù)多次。

（3）膠體磨

膠體磨的基本原理是流體或半流體物料在離心力的作用下，強(qiáng)制通過高速相對運(yùn)動的定齒與動齒之間，使物料受到強(qiáng)大的剪切力，磨擦力、高頻振動和高速旋渦等復(fù)雜力等作用，有效地被粉碎、乳化、均質(zhì)、混合，從而達(dá)到精細(xì)超微的效果。定轉(zhuǎn)子間的高速相對運(yùn)動是使膠體磨工作獲得物理微細(xì)度的主要條件，只有提高磨盤的精密度與線速度，才能達(dá)到良好的加工效果。

2. 物理破碎

（1）壓榨

壓榨是一種溫和的、*破碎細(xì)胞的方法。在1000×10⁵Pa-2000×10⁵Pa 的高壓下使幾十毫升的細(xì)胞懸液通過一個小孔突然釋放至常壓，細(xì)胞將*破碎。這是一種較理想的破碎細(xì)胞的方法，但儀器費(fèi)用較高。

（2）冷熱交替

冷熱交替是在90℃左右維持?jǐn)?shù)分鐘，立即放入冰浴中使之冷卻，如此反復(fù)多次，絕大部分細(xì)胞可以被破碎，細(xì)菌或病毒中提取蛋白質(zhì)和核酸時可用此技術(shù)。

（3）反復(fù)凍融

反復(fù)凍融是將待破碎的細(xì)胞冷至15℃-20℃，然后放于室溫（或40℃）迅速融化，如此反復(fù)凍融多次，由于細(xì)胞內(nèi)形成冰粒使剩余胞液的鹽濃度增高而引起細(xì)胞破碎。

（4）超聲波

超聲波是借助超聲波的振動力破碎細(xì)胞壁和細(xì)胞器。破碎微生物細(xì)菌和酵母菌時，時間要長一些，處理的效果與樣品濃度和使用頻率有關(guān)。使用時注意降溫，防止過熱。

3.化學(xué)與生物化學(xué)破碎

（1）有機(jī)溶劑

有機(jī)溶劑是利用氯仿、甲苯、丙酮等脂溶性溶劑或SDS（十二烷基硫酸鈉）等表面活性劑處理細(xì)胞，

可將細(xì)胞膜溶解，從而使細(xì)胞破裂，此技術(shù)也可以與研磨法聯(lián)合使用。

（2）自溶

自溶是將新鮮的生物材料存放于一定的pH 和適當(dāng)?shù)臏囟认?，?xì)胞結(jié)構(gòu)在自身所具有的各種水解酶（如蛋白酶和酯酶等）的作用下發(fā)生溶解，使細(xì)胞內(nèi)含物釋放出來，此法稱為自溶法。該法使用時要特別小心操作，因為水解酶不僅可以使細(xì)胞壁和膜破壞，同時也有可能會把某些要提取的有效成分分解。

（3）溶脹

溶脹是在低滲溶液和低濃度的稀鹽溶液中，由于存在滲透壓差，溶劑分子大量進(jìn)入細(xì)胞，將細(xì)胞膜脹破釋放出細(xì)胞內(nèi)含物。

（4）酶解

酶解是利用各種水解酶，如溶菌酶、纖維素酶、蝸牛酶和酯酶等，于37℃，pH8，處理15分鐘，可以專一性地將細(xì)胞壁分解，釋放出細(xì)胞內(nèi)含物，酶解破碎適用于多種微生物。例如從某些細(xì)菌細(xì)胞提取質(zhì)粒DNA 時，可采用溶菌酶（來自蛋清）破細(xì)胞壁，而在破酵母細(xì)胞時，常采用蝸牛酶（來自蝸牛），將酵母細(xì)胞懸于0.1mmol/L 檸檬酸一磷酸氫二鈉緩沖液（pH=5.4）中，加1%蝸牛酶，在30℃處理30分鐘，即可使大部分細(xì)胞壁破裂，如同時加入0.2%疏基乙醇效果會更好。此法可以與研磨聯(lián)合使用